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多光子显微镜

产品描述
当同时到达的两个（或更多）光子的能量和足以激发一个荧光团，便会产生多光子激发。与共聚焦显微镜相比，多光子显微镜使用近红外光在可见光范围内激发荧光团的方法可在更深的组织内成像。此外，由于信号光在空间上局限在物方焦平面，无需共聚焦针孔来产生光学切片图像，这样大大提高了探测的灵敏度。信号产生的空间限制也降低了整体的光漂白。这些优势使得多光子显微镜成为在活体组织内长时间深度成像的理想选择。

应用范围

（1）深度组织成像

多光子显微是一种能够对生物组织极深位置进行成像的技术。MPM200的扩展激发范围使其能够使用波长超过1微米的激光。因此，更多的光子可以到达样品深处的荧光团，这样就改善了最大成像深度。其与直接位于物镜后方的GaAsP光电倍增管组合的全视场非退扫描探测使得探测器可以接受更多重要的光子信号，这些光子被样品散射后仍然可以穿透物镜。

（2）活体细胞成像
多光子显微技术非常适合用于样品需要长时间成像的活体细胞研究。其高速扫描特性减少了在活体细胞成像过程中的光漂白效应，这对于细胞成像是很有利的。Thorlabs公司的多光子系统通过一个扫描振镜对实现高速扫描。该系统还采用近红外双光子激发效应，促进了样品的深度渗透，将光漂白效应最小化，与单光子激发技术相比降低了光学毒性。多光子显微技术已经成功用于追踪GFP标记的细胞和细胞结构，如C.Elegens线虫中的G蛋白受体（请参看上图）。
实时活体肾血流动的灌注检测。两个通道使用一个Olympus 20X 1.0 NA物镜以30帧/秒（512 x 512分辨率）同时进行图像采集（ThorlabsN20X-PFH）。血液是与葡萄糖（血浆，绿色）和1微米荧光微球的混合物一起灌注的。在血管中我们追踪两个独立的微球（A和B）。后续帧之间的高瞬时分辨率保证了各微球更精确的速度测量。在绿色的血浆之中我们还可以观察到一些暗色物体，这些暗色物体是红细胞，这样就为血液流动分析提供了额外的依据。这些图像是在关于肾脏研究应用显微技术的IUPUI奥布莱恩中心的研讨会期间获得的。这里向制备样品的Simon Rhodes博士致谢。

（3）用二次谐波进行无标记成像
通过双光子和三光子激发内源性荧光团、亚细胞的荧光可以不用外加荧光染料就可以进行观察。例如，NAD（P）H、维生素A或核黄素的双光子激发荧光都可以作为功能性生化信息或用作结构标记。二次谐波需要缺乏反演对称性的高度有序结构才能产生。满足该条件的最常见生物组织成分是胶原蛋白，它可以提供细胞外基质上的信息。三次谐波可以在边界界面上进行观察，它对于观察脂质体是非常有效的。

（4）活体成像
多光子显微技术可以实现深度组织成像。上图为表达td-Tomato的小鼠视觉皮层神经元的600微米深度的Z轴堆叠图像结果。神经元的长度通过追迹穿透细胞体的树突而得到。该图像由Tobias Rose博士提供，他来自德国马丁斯瑞德的马普神经生物研究所。

（5）高分辨率成像
组织内部深处结构的高分辨率成像是多光子显微技术的基础应用。由于树突结构具有亚微米量级的尺寸，因此对其成像是一个相当大的挑战。上图是表达td-Tomato的小鼠视觉皮层的神经元树突放大观察结果。

产品规格

Microscope
Stand	Upright Nikon FN1
Recommended Objectives	Nikon CFI LWD 16XW, 0.80NA,WD 3.0 mm; Nikon CFI Apo 25XW, 1.10NA,WD 2.0 mm; Nikon CFI Apo Lambda S LWD 40XW, 1.15NA,WD 0.61 mm; Nikon CFI Apo Lambda S 40XW, 1.25NA,WD 0.18 mm; Nikon CFI Plan Apochromat 60XW, 1.20NA,WD 0.27mm; Olympus XLUMPLFLN 20XW, 1.0NA,WD 2.0 mm, Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NAWD 15 mm
Z-Drive	Minimum Step Size: 0.1 μm
XY Stage (Optional)	FN1 XY Rectangular Stage (Manual); XY Physiology Stage (Manual or Motorized)
Excitation
Beam Conditioner (Optional)	Variable Beam Expander (1X - 4X); Motorized Beam Attenuation (λ/2 Wave Plate and Polarizer)
Dispersion Pre-Compensation	-6300 fs2
Wavelength Range	680 - 1400 nm
Objective Pupil Diameter	20 mm (Max)
Field of View	16 mm Diagonal Square (Max) at the Intermediate Plane 700 µm x 700 µm with Nikon 16X Objective at Sample
Scanner	X: 7.8 kHz Resonant Scanner Y: Galvonometric Scan Mirror
Scan Speed	30 fps @ 512 x 512 Pixels
Scan Zoom	1X to ~8X (Approximate)
Scan Resolution	Up to 2048 x 2048 Bi-Directional Acquisition Up to 4096 x 4096 Uni-Directional Acquisition
Scan Mode	Point X-Y Scan
Primary Dichroic	680 -1600 nm Longpass
Detection
Non-Descanned (NDD) Detectors	Two Ultra-Sensitive GaAsP PMTs Positioned Directly Behind the Objective
Wavelength Range	300-720 nm
Filter Cube	Single, User-Changeable

原理图
一台典型的多光子装置，包括显微镜的、一个光束调整器（MPM-BCU）、一个色散补偿设备（DCOMP-BCU）和一个激光光源（通用）。上图显示了在一个PHYS24M生理学平台上的MPM200-4四通道多光子显微镜，该平台带有MPM-BCU光束调节器和COMP6300色散预补偿器件，它们都放置在一个5英尺 x 6英尺的SDA150180 ScienceDesk™工作台上。

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